腸桿菌和其它非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）20E是經典的微量生化鑒定系統，廣泛用于臨床、食品、環境及科研實驗室對腸桿菌科及部分非苛養革蘭氏陰性桿菌的表型鑒定。該系統基于20項生化反應的比色或熒光變化，通過數值編碼與數據庫比對實現菌種識別。為確保鑒定結果的準確性與可重復性，嚴格遵循標準化操作流程。
一、實驗前準備
1. 菌株要求：待測菌應為純培養、18–24小時新鮮培養物，生長于非選擇性培養基（如血瓊脂或麥康凱平板），且為革蘭氏陰性桿菌。
2. 試劑與耗材：確認API 20E試劑條在有效期內，儲存于2–8°C；準備0.85%無菌NaCl溶液、礦物油（用于需厭氧反應的孔位）及比色卡。
3. 菌液標準化：用無菌生理鹽水或專用懸浮液制備菌懸液，調整至0.5 McFarland濁度標準。此濃度是保證反應靈敏度與特異性的關鍵，過高或過低均會導致假陽性或假陰性。
二、加樣與孵育
1. 加樣操作：
使用接種針或微量移液器，將菌懸液依次注入20個微孔，每孔加滿，避免氣泡產生。
第21孔（通常為空白對照或用于后續補充試驗，不加菌液。
2. 礦物油覆蓋：
對需厭氧環境的生化反應孔，需在加樣后覆蓋1–2滴無菌礦物油（約50 μL），以隔絕氧氣，促進脫羧酶或硫化氫反應。具體需加油孔位詳見說明書（通常為孔1–7中的部分孔）。
3. 孵育條件：
將試劑條置于35±2°C恒溫培養箱中孵育18–24小時。不可縮短時間（反應未完成）或延長超過24小時（可能導致非特異性反應）。
三、結果判讀與編碼
1. 顯色判讀：
孵育結束后，逐孔觀察顏色變化。多數反應通過pH指示劑顯色（如黃色=陽性，藍色/綠色=陰性）；H?S反應通過黑色沉淀判斷；IND孔需加入1滴API IND試劑（對二甲氨基苯甲醛）后觀察紅色環（陽性）。
2. 數值編碼：
將20項結果按3-3-3-3-3-3-2分組（共7組），每組陽性反應賦值，相加得組值，形成7位數字編碼。
3. 數據庫比對：
通過在線系統或配套軟件輸入編碼，獲取鑒定結果（包括菌種名稱、T指數/T%值）。
四、質量控制與注意事項
避免交叉污染：每測試一株菌更換吸頭或接種環。
不可重復使用：試劑條為一次性設計，禁止部分使用或保存再用。
結果時效性：應在孵育結束后2小時內完成判讀，久置可能導致顏色褪變。
結語
腸桿菌和其它非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）20E作為經典的表型鑒定工具，其操作雖看似簡單，但每一步均影響鑒定準確性。只有嚴格遵循標準化流程，注重菌液濃度、孵育時間、顯色判讀等細節，并結合質控與數據庫更新，才能充分發揮其在革蘭氏陰性桿菌鑒定中的價值。
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